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激光共聚焦實驗的樣品準備方法對比
2016-05-05 13:56:14 來源：
1.比較常用的是使用170μm左右厚度的蓋玻片作為激光共聚焦成像的細胞載體。但是使用蓋玻片，在實驗操作上是非常麻煩的，如果買的是國產的蓋玻片，首先要做的一步是將蓋玻片清洗并且烘干滅菌，才能開始使用。
2.進口的細胞爬片，雖然不需要清洗，但是還是需要進行包被才能讓細胞正常貼壁生長。通常是將處理好爬片直接放在多孔板中，然后鋪細胞，熒光染色后，再用鑷子將爬片拿出，反過來放在滴有封片劑（甘油配置）的載玻片上，再進行成像。如圖一所示： 圖一：使用蓋玻片和細胞爬片的做免疫熒光方法示意圖。 操作流程： 蓋玻片需用濃硫酸浸泡過夜，第二天用自來水沖洗20遍，置于無水乙醇中6小時，后用三蒸水沖洗3遍，再放在飯盒或玻璃培養皿中烘干，消毒，再烘干后放入超凈臺備用。 準備好的蓋玻片或者*的細胞爬片需要根據細胞的貼壁情況使用多聚賴氨酸等蛋白包被。 培養板中放置爬片非常有技巧，要將爬片與培養板底部緊密貼合，這樣才能避免長成雙層細胞。 常規免疫熒光操作后，取出爬片。準備載玻片一張，在中間滴加適量的封片劑（甘油配置），將蓋玻片或爬片翻過來，蓋在封片劑上，再用指甲油封片進行成像。 在激光共聚焦成像之前，*好用熒光顯微鏡檢查一下細胞狀態和成像效果，再去做激光共聚焦，畢竟做一次激光共聚焦的成像也不便宜的。
無需爬片的新方法 這里要介紹的新方法，大大簡化了樣品準備流程，需要用到專為共聚焦實驗設計的共聚焦培養皿，這里以德國ibidi的共聚焦培養皿為例（81156，德國ibidi）進行說明。共聚焦培養皿的底部是聚合物材質，具有親水表面，讓大多數種類的細胞都可以直接貼壁，無需另外進行包被；同時，它們的底部符合蓋玻片標準——只有180m的厚度，在折射率，阿貝系數上，它們的性能和標準爬片一致，再加上極低的自發熒光和細胞可以直接貼壁的特性，使它們成為共聚焦成像的專用培養皿。 所有的操作都在培養皿中進行，不再需要鑷子以及繁瑣的清洗，滅菌，包被程序（流程如圖二所示） 圖二：共聚焦專用培養皿的準備樣品流程，可以直接進行細胞培養－染色－成像操作（圖中為德國ibidi 81156培養皿） 操作流程 在超凈臺中打開共聚焦專用培養皿的滅菌包裝，拿出培養皿，加入細胞懸液，蓋上皿蓋，放入培養箱中靜置，等待細胞貼壁。常規細胞培養，待細胞長置合適密度再取出，進行免疫熒光染色。
吸出培養基，以PBS清洗細胞，再用2%的多聚甲醛PBS溶液固定細胞。 20分鐘后，吸出固定液，加入0.1%Triton X-100 10分鐘后，吸出Triton，清洗細胞后加入BSA封閉。 加入抗體熒光染色后，吸出所有試劑，加入封片劑，可以開始共聚焦顯微成像。 使用共聚焦培養皿還有個好處：往往一個共聚焦掃描成像持續時間很長，培養皿中的液體非常容易揮發，共聚焦培養皿有皿蓋，可以減少揮發；比如上述提到的ibidi共聚焦培養皿，有個巧妙的鎖扣設計，可以扣緊培養皿，保證在共聚焦成像的過程中，皿中的液體不會揮發(圖三）。 圖三：ibidi共聚焦培養皿的鎖扣設計 方法優勢總結
1.一個培養皿完成細胞培養－染色－成像等系列操作，無需包被，無需爬片，操作簡便；
2.在培養皿里的操作對于操
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